索氏梭菌（Paeniclostridium sordellii）是一種可以引發(fā)急性感染的革蘭氏陽性細(xì)菌，環(huán)境分布廣泛。索氏梭菌感染不多見卻非常致命，可引發(fā)毒血癥，氣性壞疽，低血壓和休克等癥狀，尤其對于分娩或流產(chǎn)的女性風(fēng)險(xiǎn)極高，急性感染發(fā)生后的致死率近100%。索氏梭菌含致死毒素（TcsL）和出血毒素（TcsH）兩種外毒素，其中致死毒素被認(rèn)為是造成其高致死率的主要毒力因子。
組合重復(fù)寡肽（Combined Repetitive Oligopeptides, CROPs）是一段位于TcsL羧基端的重復(fù)序列結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)目前發(fā)現(xiàn)僅存在于包括TcsL在內(nèi)的大部分大梭菌毒素家族蛋白中，然而一直以來人們對其在毒素蛋白中的功能了解甚少。
北京時(shí)間2023年12月19日，陶亮團(tuán)隊(duì)與合作者在Nature Communications上在線發(fā)表題為“Structural dynamics of CROPs control the stability and toxicity of Paeniclostridium sordellii lethal toxin”的研究論文（圖1），揭示了TcsL的組合重復(fù)寡肽區(qū)域具有調(diào)控毒素自剪切和毒性的功能，并從生化、細(xì)胞和結(jié)構(gòu)層面闡述了其工作機(jī)制；研究還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這種自調(diào)控機(jī)制在其它大梭菌毒素家族成員中也可能普遍存在。
文章鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41467-023-44169-z
圖1. 論文截圖
為了探究組合重復(fù)寡肽結(jié)構(gòu)域的功能，研究團(tuán)隊(duì)首先在枯草芽孢桿菌系統(tǒng)中表達(dá)了全長和組合重復(fù)寡肽缺失的TcsL蛋白。期間團(tuán)隊(duì)成員發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有趣的現(xiàn)象：組合重復(fù)寡肽缺失的TcsL在蛋白純化過程中會(huì)自發(fā)進(jìn)行切割。通過質(zhì)譜分析和突變實(shí)驗(yàn)證實(shí)切割位點(diǎn)位于543位的亮氨酸和544位的甘氨酸，這是TcsL中的半胱氨酸蛋白酶的自剪切位點(diǎn)。在全長蛋白中，需要較高濃度的六磷酸肌醇（InsP6）才能激活半胱氨酸蛋白酶的自切割活性，這說明缺失組合重復(fù)寡肽結(jié)構(gòu)會(huì)造成TcsL中的半胱氨酸蛋白酶活性失控變得過度活躍（圖2）。
圖2. 缺失組合重復(fù)寡肽區(qū)域會(huì)造成TcsL中半胱氨酸蛋白酶活性失控
為了進(jìn)一步分析組合重復(fù)寡肽區(qū)域中抑制半胱氨酸蛋白酶活性的序列位點(diǎn)，研究者們構(gòu)建了一系列毒素的截短和突變體，通過InsP6誘導(dǎo)的體外酶切實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不同長度的組合重復(fù)寡肽片段對半胱氨酸蛋白酶的活性有著不同程度的影響。更有趣的是，缺失了組合重復(fù)寡肽的TcsL在細(xì)胞上的毒性甚至高于全長TcsL，說明該結(jié)構(gòu)區(qū)域還影響了毒素的細(xì)胞毒性（圖3）。
圖3. 不同長度的組合重復(fù)寡肽對TcsL自剪切和細(xì)胞毒性的影響
之后，陶亮團(tuán)隊(duì)與施一公團(tuán)隊(duì)開展合作，利用冷凍電鏡單顆粒三維重構(gòu)技術(shù)解析了在中性條件下和酸性條件下TcsL全長蛋白的三維結(jié)構(gòu)。研究者發(fā)現(xiàn)，在中性條件下，TcsL呈現(xiàn)一種開放式的構(gòu)象；而在酸性條件下，組合重復(fù)寡肽區(qū)域會(huì)發(fā)生近180°的旋轉(zhuǎn)，形成一種關(guān)閉式的構(gòu)象。其中關(guān)閉式的構(gòu)象中，組合重復(fù)寡肽區(qū)域與其它結(jié)構(gòu)域之間產(chǎn)生了兩個(gè)分子內(nèi)的互作界面，從而牢牢地“鎖住”了毒素的其它區(qū)域（圖4）。
圖4. TcsL存在開放和關(guān)閉這兩種不同的構(gòu)象，其中關(guān)閉式構(gòu)象會(huì)形成兩個(gè)分子內(nèi)作用界面
接下來，研究者們模擬了TcsL釋放到環(huán)境中，之后再接觸宿主的情形。利用小鼠攻毒模型結(jié)合病理分析，研究者發(fā)現(xiàn)缺少組合重復(fù)寡肽區(qū)域的TcsL在存在InsP6的環(huán)境中暴露僅僅20分鐘即會(huì)完全失活，這對于一種外毒素來說是不可接受的缺點(diǎn)。而全長的TcsL在類似環(huán)境下30分鐘也不會(huì)有任何活性損失（圖5）。最后，研究者們還將這一規(guī)律在大梭菌毒素家族的其他成員，包括TcdA，TcdB，TcsH和Tcnα中進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)它們的組合重復(fù)寡肽區(qū)域也有著類似的作用。
圖5. 缺少組合重復(fù)寡肽區(qū)域的TcsL很容易在接觸宿主前就發(fā)生失活
基于上述發(fā)現(xiàn)，研究者們提出了一種組合重復(fù)寡肽區(qū)域調(diào)控TcsL及其它大梭菌毒素穩(wěn)定性和毒性的模型（圖6）。作為一類外毒素，TcsL在被細(xì)菌釋放到胞外后將面臨各種復(fù)雜的環(huán)境條件。毒素可能以開放和關(guān)閉兩種構(gòu)象存在，其中開放式構(gòu)象的組合重復(fù)寡肽區(qū)域舒展，暴露出毒素的核心區(qū)，這種構(gòu)象對于攻擊宿主細(xì)胞更為有利。而在一些相對嚴(yán)厲的條件下（如低pH值等），毒素傾向于轉(zhuǎn)變?yōu)殛P(guān)閉式的構(gòu)象，這種構(gòu)象分子結(jié)構(gòu)更為緊密和牢固，不易發(fā)生自剪切和降解。這種構(gòu)象更利于維持毒素的穩(wěn)定性和活性，直至毒素分子接觸到其目標(biāo)宿主細(xì)胞。
圖6. 研究者提出的組合重復(fù)寡肽自調(diào)控毒素分子穩(wěn)定性和毒性的模式圖
西湖大學(xué)微生物宿主交互實(shí)驗(yàn)室（實(shí)驗(yàn)室主頁：https://tao.lab.westlake.edu.cn/）致力于研究微生物-宿主之間的相互作用方式和內(nèi)在規(guī)律，尤其是從分子、生化、細(xì)胞、病理、遺傳等多角度研究重要病原細(xì)菌及其致病因子對宿主的影響及作用機(jī)制。西湖大學(xué)醫(yī)學(xué)院/生命科學(xué)學(xué)院研究員陶亮近年來以通訊作者在Cell、Cell Research、Nature Microbiology、Nature Communications、PLOS Pathogens等學(xué)科主流期刊上發(fā)表多篇學(xué)術(shù)論文。實(shí)驗(yàn)室長期招收博士后、博士生和科研助理，方向包括且不限于微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、化學(xué)生物學(xué)、分析組學(xué)、免疫學(xué)等，誠邀各方青年才俊加入、攜手共同成長！有意者請聯(lián)系陶亮博士（taoliang@westlake.edu.cn）。
來源 / 陶亮團(tuán)隊(duì)
編輯 / 陳一鳴
校對 / 朱逸青
審核 / 李凱娜
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